Teknik Kultur Protoplas

TEKNIK KULTUR JARINGAN PROTOPLAS

JURUSAN AGROTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA

2014

PENDAHULUAN

            Salah satu karakteristik sel tumbuhan adalah mempunyai dinding sel tebal dan kaku yang mengelilingi dan melindungi membran plasma serta bagian dalam dari sel. Struktur utamanya berupa selulose dan hemiselulose dengan substansi pektat sebagai bahan pengikat antar sel tanaman. Sebagai pendukung mekanik dari jaringan tanaman, dinding sel sangat komplek dan sangat tinggi diferensiasinya. Pada sel-sel tertentu dinding sel primer, sekunder dan tersier terkumpul secara berlapis-lapis selama pertumbuhan. Ketiadaan dinding sel sebagai barier mekanik memungkinkan dilakukanya peleburan protoplas yang diperoleh dari sel-sel somatik dari jenis tanaman yang berbeda. Sebagai hasil dari hibridisasi somatik, dimungkinkan terjadinya kombinasi genetik baru.

            Protoplas pada dasarnya adalah sel hidup dikurangi dinding selnya atau sering disebut sebagai sel telanjang dan sebagai satu-satunya pembatas adalah membran plasma yang membatasi lingkungan luar dengan bagian dalam sel. Sel yang sudah kehilangan dinding selnya akan menghadapi perubahan tekanan osmotik yang sangat drastis dan berbeda dengan lingkungannya semula. Tekanan osmotik yang terlalu tinggi atau terlalu rendah dapat merusakkan viabilitas protoplas, namun pada lingkungan dengan tekanan osmotik yang cocok dapat memelihara kestabilan protoplas lebih lama. Penghilangan dinding sel dapat dilakukan secara mekanik atau ensimatik. Oleh karena itu protoplas membutuhkan proteksi osmotik didalam medium sampai dinding sel terbentuk, osmotikum dibutuhkan mulai dari isolasi sampai kultur. Sedangkan eksplan yang dapat digunakan untuk isolasi protoplas adalah semua bagian tanaman yang masih muda.

            Permasalahan yang dijumpai pada isolasi protoplas adalah sebagai berikut:

1.      Penghilangan dinding sel, dinding sel yang hams dihilangkan pada isolasi protoplas umumnya terdiri dari suatu senyawa yang komplek. Penghilangan dinding sel harus diikuti dengan terbebasnya protoplas dalam jumlah yang cukup banyak.

2.      Protoplas yang sudah tidak berdinding akan menghadapi perubahan tekanan osmose yang sangat drastis dan berbeda dengan lingkungannya semula, sehingga didalam medium untuk isolasi maupun budidaya harus ditambahkan zat anti blasting untuk mencegah pecahnya protoplas. Biasanya digunakan sorbitol atau mannitol (0,5 - 0,7) M.

3.      Protoplas sebagai sel telanjang harus tetap mampu mengadakan reproduksi, dan pada waktunya harus dapat membentuk dinding selnya kembali apabila dibudidayakan pada medium yang sesuai.

4.      Untuk mendapatkan protoplas yang maksimal, diperlukan bahan tanam atau eksplan yang cocok.

Banyak publikasi yang melaporkan bahwa keberhasilan kultur protoplas dan regenerasinya ditentukan oleh beberapa faktor, seperti genotipe dan jaringan yang digunakan, fisiologi jaringan, jenis dan konsentrasi enzim, masa inkubasi, media kultur, zat pengatur tumbuh, dan kondisi inkubasi (Bradsaw dan Mackey 1994 dalam Deden et al., 2007). Protoplas dapat diisolasi dari hampir semua bagian tanaman, seperti akar, daun, nodul akar, koleoptil, kultur kalus dan daun in vitro (Husni et al. 2003 dalam Deden et al., 2007).

            Protoplas sudah berhasil diisolasi dari banyak spesies tumbuhan, ketiadaan dinding sel sebagai barier mekanik memungkinkan protoplas dipergunakan untuk berbagai keperluan:

1.      Dilakukannya peleburan protoplas yang diperoleh dari sel-sel somatik dari jenis tanaman yang berbeda, sebagai hasil dari hibridisasi somatik, dimungkinkan terjadinya kombinasi genetik baru.

2.      Studi introduksi DNA asing, organel, partikel bakteri atau virus.

3.       Mendapatkan tanaman dengan sifat yang lebih baik melalui variasi somaklonal.

PEMBAHASAN

I.            Penghilangan dinding sel

     Isolasi protoplas dengan cara mekanik dikerjakan dengan memotong eksplan didalam larutan plasmolitikum. Protoplas akan mengkerut, sehingga dapat ditekan keluar dari dinding sel. Deplasmolisis selanjutnya akan menyebabkan terlepasnya protoplas dari sel-sel. Kelemahan penggunaan teknik ini adalah relatif sukar, jumlah protoplas yang dihasilkan tidak banyak, keefektifannya dibatasi hanya pada sel-sel yang dapat diplasmolisa seperti jaringan penyimpan dan tidak dapat digunakan pada jaringan meristem karena dinding selnya masih sangat erat berhubungan dengan protoplas. Kelebihannya dapat meniadakan efek dari aktifitas ensim yang kadang-kadang merusak atau mengganggu metabolisme yang sangat komplek didalam protoplas.

     Sejak ditemukan oleh Cocking pada tahun 1960, isolasi protoplas secara enzimatik hampir selalu digunakan untuk setiap jenis tanaman sampai sekarang. Teknik tersebut dapat dihasilkan populasi protoplas dengan jumlah kerapatan yang tinggi (2,5x10⁶ protoplas/gram jaringan daun). Larutan enzim  yang digunakan untuk isolasi protoplas komposisinya bermacam-macam. Untuk melisiskan dinding sel dengan baik dapat dilakukan dengan menggunakan kombinasi dua macam ensim yaitu Cellulase dan Pectinase secara simultan. Pektinase akan melonggarkan ikatan antara sel yang satu dengan sel yang lain atau melepaskan sel, sedangkan Cellulase akan menghancurkan dinding selulosa sehingga sel menjadi telanjang.

     Beberapa peneliti telah menggunakan kombinasi ensim Larkin (1976 dalam Elisa 2012) menggunakan Celulase Onozuka P1500 3% dan Macerozym 0,25% untuk mengisolasi protoplas daun Nicotiana dan perhiasan bunga Petunia. Hahne et al,. (1982 dalam Elisa 2012) menggunakan larutan ensim yang terdiri dari Cellulase (Roem, Darmstadt) 1%, Pectinase (PATE, Hoeschst) 0,1%, Macerozyme R-10 0,1% dan mannitol 0,4M pada pH 5,8. Ensim Cellulase yang sering digunakan ialah Driselase dan Selulisin.

II.            Mekanisme kultur protoplas

1.      Penghilangan dinding sel.

Ambil 5 helai daun anggrek masing-masing dengan panjang ± 3 cm, dengan menggunakan scalpel tajam daun diiris-iris ± 1 mm, irisan segera dimasukan dalam Erlenmeyer 50 ml yang berisi larutan ensim sebanyak 25 ml, letakkan diatas shaker (penggojok) 20 rpm dalam gelap selama 24 jam. Perlakuan lain bisa juga tanpa penggojokan dengan variasi waktu yang berbeda-beda dan diinkubasikan dengan pencahayaan 1000 lux.

2.      Pencucian protoplas.

 Erlenmeyer yang berisi suspensi protoplas digoyang pelan-pelan supaya protoplas terlepas dari ikatan jaringan dan suspense menjadi homogen, kemudian disaring dengan nilon filter, protoplas yang sudah disaring ditampung dalam tabung centrifugasi. Suspensi protoplas kemudian disentrifugasi 500 rpm selama 10 menit, protoplas akan mengendap. Dengan menggunakan pipet Pasteur, supernatant (larutan bagian atas) dibuang . Masukkan larutan pencuci secara perlahan, caranya dengan menggunakan pipet larutan pencuci diteteskan melalui dinding tabung, resuspensikan dengan hati-hati sampai homogen. Suspensi protoplas kemudian disentrifugasi 500 rpm selama 5 menit, protoplas akan mengendap, dengan pipet Pasteur supernatant dibuang. Masukan 1 ml larutan pencuci, resuspensikan dengan hati-hati sampai suspensi protoplas homogen.

3.      Pemurnian protoplas.

Dengan menggunakan pipet Pasteur, masukan 3 ml larutan sukrosa dengan cara memasukkan ujung pipet sampai dasar  tabung, kemudian dengan hati-hati larutan sukrosa dikeluarkan. Suspensi protoplas akan mengapung diatas permukaan. Lakukan sentrifugasi 500 rpm selama 10 menit, protoplas akan terpisah dari debris. Protoplas murni ada dilapisan atas sedangkan debris ada di dasar tabung. Dengan menggunakan pipet ambilah suspensi protoplas murni yang ada dipermukaan, masukkan dalam tabung sentrifugasi baru, tambahkan 1 ml medium MSP cair, hitung kerapatan protoplas dengan hemositometer, atur supaya kerapatan protoplas 1x105 protoplas/ml denga menambahkan medium kultur.

4.      Kultur protoplas.

Ambil protoplas dengan pipet mikro 100 \i\ teteskan 3-4 tetes kedalam petridish berdiameter 3 cm, simpan didalam petridish berdiameter 5 cm yang berisi potongan kertas saring basah kemudian disegel dengan parafilm, simpan dalam inkubator gelap dengan suhu 25°C. Amati perkembangan protoplas setelah 2-3 hari dibawah mikroskop inverted (Elisa 2012).

III.            Hal-hal yang perlu diperhatikan selama proses kultur protoplas

     Protoplas yang sudah dikulturkan secara perlahan mulai meregenerasikan dinding selnya, sintesis dinding sel baru umumnya berlangsung beberapa jam setelah protoplas dikulturkan dan akan terus berlangsung selama 2-3 minggu. Pada saat ini, tekanan osmotik medium perlahan-lahan harus diubah (diturunkan) dengan jalan meneteskan medium tanpa mannitol atau sorbitol. Bila tekanan osmotik medium tidak diubah, tekanan osmotik yang tinggi dapat menghambat pembelahan sel. Strategi yang digunakan untuk mengurangi osmotikum secara gradual adalah dengan mencampur osmotikum mannitol dan sukrosa didalam medium kultur . Sukrosa akan dengan cepat dimetabolisir oleh protoplas sehingga dapat mengurangi osmolaritas dari medium kultur.

     Sebagai eksplan yang digunakan untuk isolasi protoplas sebaiknya dipakai jaringan atau organ yang sel-selnya masih muda. Sel-sel yang masih muda atau meristem diperkirakan dinding selnya baru sampai penebalan primer dari zat pektin dan selulosa, sehingga relatif lebih mudah untuk dihancurkan. Eksplan yang demikian berasal dari jaringan parenkim primer, daun atau organ tanaman yang lain, kalus dari hasil budidaya jaringan dan kultur suspensi sel, yang paling banyak digunakan adalah mesofil daun, sel-sel mesofil daun mempunyai keistimewaan, yaitu mengandung kloroplas atau plastida sehingga protoplas mudah diidentifikasi, letak sel yang satu dengan sel yang lain relatip renggang sehingga memudahkan penetrasi larutan enzim

     Untuk bahan daun biasanya diinkubasi semalam atau 12-18 jam dalam larutan enzim, diletakkan diatas penggojok berkecepatan rendah, kondisi gelap, pada suhu 25°C. Setelah waktu inkubasi selesai, suspensi protoplas harus dipisahkan dari larutan ensim. Masih terdapatnya sisa-sisa larutan ensim dapat menghambat pembentukan dinding sel kembali, oleh karena itu harus dilakukan prosedur pemurnian protoplas atau purifikasi. Purifikasi dilakukan dengan penyaringan, centrifugasi dan pencucian. Untuk mendapatkan protoplas intak dapat diberi perlakuan gradient sukrosa. Sukrosa dengan berat molekul tertentu akan dapat mengendapkan debris yang berupa sisa-sisa jaringan epidermal, jaringan pengangkut, protoplas yang rusak dan agregat sel, sedangkan protoplas yang viabel akan mengapung dipermukaari larutan. Metode lain yang hampir sama dengan prinsip diatas adalah dengan menggunakan larutan ficoll (polisukrose).

     Viabilitas protoplas dapat diuji dengan pengecatan protoplas menggunakan cat Fluorescein, yaitu FDA (Fluoresceindiacetat), Calcofluor White (untuk regenerasi dinding sel) atau pewarnaan ganda FDA dengan PI (Propidium Iodide). Dua cat fluorescein yang disebut pertama, hanya dapat mewarnai protoplas yang viabel, karena cat hanya dapat terkumpul pada plasmalema protoplas yang masih hidup, dapat dideteksi dengan mikroskop fluoresensi. PI dapat mewarnai sel-sel mati, dengan pewarnaan ganda protoplas yang hidup maupun yang mati dapat dideteksi. Dodds dan Roberts (1983) menggunakan Evan's Blue 0,1% untuk menguji viabilitas protoplas. Protoplas yang viabel akan mampu menolak masuknya zat warna biologis tersebut. Impermeabilitas sel untuk cat ini dapat digunakan sebagai indikator viabilitas protoplas.

     Perkembangan protoplas dapat diamati secara langsung dibawah mikroskop inverted, dalam waktu 2-3 minggu protoplas yang viabel telah dapat meregenerasikan dinding selnya secara penuh. Pada saat ini, tekanan osmotik medium perlahan-lahan diubah dengan meneteskan medium tanpa mannitol atau sorbitol, bila tekanan osmoti medium tidak diubah dapat mtnghambat pembelahan sel. Indikator terbaik untuk melihat perkembangan protoplas adalah dengan pengecatan Calcofluor White (CW), cat ini spesifik mengikat (β,1- 3 glucan pada dinding sel). Protoplas yang dicat dengan CW dapat difisualisasikan dengan mikroskop fluorescent.

IV.            Tingkat keberhasilan kultur protoplas

     Keberhasilan protoplas adalah penentuan pH dan osmolaritas. Biasanya pH yang lebih sesuai untuk pertumbuhan kultur protoplas adalah 5,5-5,8. Osmolaritas berksar antara 0,35-0,70 M, sedangkan temperature yang sesuai adalah 33-28˚C. Cahaya juga merupakan faktor penting untuk pertumbuhannya, intensitas cahaya yang rendah yaitu 2000 lux adalah yang terbai. Kerapatan protoplas bervariasi antara 104-106 per mili liter (Issirep Sumarrdi 1989 dalam )

     Terlaksananya fusi protoplas didapatkan manfaat sebesar-besarnya karena berarti dihasilkan varietas baru yang mempunyai sifat-sifat baik seperti yang diinginkan. Fusi protoplas yang telah berhasil antara lan adalah tanaman kedelai dengan tembakau, gandum atau jagung dengan padi, juga antara gandum dengan wortel dan koro, serta antara jagung dan tebu (Daisy Dan Ari 2008).

PENUTUP

Fusi protoplasma merupakan penggabungan dua protoplasma atau lebih menjadi satu individu baru yang sanggup tumbuh dan berkembangbiak. Tujuan fusi protoplas adalah untuk mendapatkan suatu hibrida somatik atau mengatasi kelemahan dari hibrida seksual. Teknik kultur protoplas memiliki kelebihan dan kekurangan berupa:

·         Kelebihan dari teknik ini adalah dapat menghasilkan tanaman dengan sifat tertentu dan dapat dilakukan dengan spesies yang berbeda.

·         Kekurangan dari teknik ini adalah memerlukan biaya yang mahal serta butuh ketelitan yang lebih.

Mekanisme kultur protoplas dapat melalui tahap-tahap sebagai berikut:

1.      Penghilangan dinding sel

2.      Pencucian protoplas

3.      Pemurnian protoplas

4.      Kultur protoplas

DAFTAR PUSTAKA

Daisy P. Sriyanti Hendaryono, Ari Wijayani. 2008. TEKNIK KULTUR       JARINGAN, Pengenalan dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara           Vegetatif Modern. Yogyakarta: Kanisius.

Deden Sukmadjaja, Novianti Sunarlim, Endang G. Lestari, Ika Roostika, dan        Tintin Suhartini. 2007. Teknik Isolasi dan Kultur Protoplas Tanaman Padi.   Jurnal AgroBiogen 3(2):60-65, http://biogen.litbang.deptan.go.id diakses            pada 9 April 2014.

Elisa. 2012. Kultur Protoplas. http://elisa.ugm.ac.id diakses pada 9 April 2014.